小角X-射線散射廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)來(lái)確定蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。溶液中的生物大分子可以以多種構(gòu)象存在，并且一般具有很強(qiáng)的團(tuán)聚傾向，在沒(méi)有預(yù)先純化的情況下，對(duì)此類(lèi)分子的數(shù)據(jù)解釋有時(shí)會(huì)很繁瑣。

       分子排阻凝膠色譜 (SEC) 能夠根據(jù)分子的大小進(jìn)行分離。SEC 與SAXS 聯(lián)用可以顯著提高數(shù)據(jù)質(zhì)量，從而提高數(shù)據(jù)解釋的準(zhǔn)確性。

       小角X-射線散射 (SAXS) 是生物化學(xué)等大分子樣品研究中常用的方法。在過(guò)去的幾年里，由于光束傳輸（第3代和第4代同步加速器、現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室X-射線源）、探測(cè)技術(shù)和數(shù)據(jù)解析方面的進(jìn)步，SAXS 測(cè)量取得了顯著的增長(zhǎng)。

       在現(xiàn)代同步加速器設(shè)備中，分子排阻凝膠色譜 (SEC) 是在SAXS線站上建立的一種制備方法。尺寸不同的分子混合物（如單體、二聚體等）經(jīng)過(guò)SEC純化，可以得到單分散組分。其基本原理是不同尺寸的大分子在多孔色譜樹(shù)脂上的停留時(shí)間不同。因此，大分子比小分子的洗脫速度快，使得按大小將單個(gè)的餾分分開(kāi)。SEC實(shí)驗(yàn)通常是通過(guò)紫外吸收測(cè)量來(lái)確定哪個(gè)時(shí)間哪個(gè)組分被洗脫。

       實(shí)驗(yàn)室儀器的最新進(jìn)展（如基于液態(tài)金屬靶材或高功率的封閉靶等高性能SAXS儀器）使得這種方法也可以適用于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，為研究和常規(guī)測(cè)量提供了更多的可能性。這里我們所示的SEC-SAXS 聯(lián)合實(shí)驗(yàn)是在安東帕的SAXSpace儀器上對(duì)HSA蛋白樣品進(jìn)行的，以說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室儀器上進(jìn)行測(cè)量的潛力。

       使用標(biāo)準(zhǔn)的FPLC系統(tǒng)和安東帕SAXSpace儀器搭建在線SEC–SAXS 。由于在線測(cè)量的性質(zhì)，樣品的特定組分從SEC柱中洗脫時(shí)直接測(cè)量。

       利用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室SAXS儀器的高通量，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠好信噪比的蛋白質(zhì)散射數(shù)據(jù)。

       通過(guò)將人血清白蛋白HSA溶解到緩沖溶液中，制備了人血清白蛋白樣品溶液。所使用的緩沖溶液 (pH 7.5) 組分為20 mM 三（三（羥甲基）氨基甲烷）、150 mMol NaCl和3 % 的甘油。最終HSA濃度為20 mg/mL。

       樣品在注射到SEC柱之前沒(méi)有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的純化。使用GE Äkta Pure 25 FPLC儀器進(jìn)行了分子排阻色譜分析。

       SAXSpace 儀器的FlowCell中的管子可直接連接到Äkta Pure 25 SEC 儀器UV 傳感器的出口，以盡量減小管子長(zhǎng)度。

       對(duì)單體蛋白質(zhì)分子的原始散射數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。確定了單體洗脫峰的散射曲線，并取其平均值�？偣驳玫搅诉@個(gè)區(qū)域內(nèi)具有恒定散射曲線的10幀數(shù)據(jù)。然后使用 SAXSanalysis 軟件對(duì)這10幀數(shù)據(jù)進(jìn)行平均并進(jìn)行背景扣除

       即使在總共只有100 s的極短曝光時(shí)間內(nèi)，也能獲得極好的數(shù)據(jù)質(zhì)量。這允許使用SAXSanalysis 對(duì)散射曲線進(jìn)行Guinier外推來(lái)計(jì)算回轉(zhuǎn)半徑（Rg）。

       Rg值為2.8 nm，這與文獻(xiàn)值吻合較好。

       為了獲得實(shí)空間結(jié)構(gòu)的信息，利用GIFT軟件對(duì)散射曲線進(jìn)行了傅里葉變換。

       在實(shí)驗(yàn)室儀器如安東帕SAXSpace和SAXSpoint等儀器上使用在線SEC-SAXS大大提高了在自己實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的可能性。

       即使是具有很強(qiáng)團(tuán)聚傾向的蛋白質(zhì)也很容易被測(cè)定，因?yàn)榉蛛x和測(cè)定之間沒(méi)有延遲。由于測(cè)量可以在停止流動(dòng)模式下，因此也可以測(cè)量高度稀釋低聚物和弱散射小分子。這進(jìn)一步減少了同步加速器測(cè)量的需求，減少了旅行時(shí)間和敏感樣品的運(yùn)輸。